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液相色譜,你問我答(八)

時間:2021-12-09 點擊次數:86

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一、理論塔板數下降 。


柱子在使用過程中分離性能逐步降低是正?,F象。但是如果發生突然降低或改變,屬于異?,F象。此時,應分析原因,有針對的采取措施,避免這種情況發生,或及時進行柱子再生,以求盡可能地恢復其性能。造成柱效下降的原因有很多,但最基本的原因是使用不當,造成填料特性或柱床結構的改變所致。

1、pH值流動相的pH值是柱子使用中最需要注意的參數。以硅膠為基質的色譜填料通常僅適于在pH值2~8的范圍內使用。過低過高的pH值都會造成填料配基脫落或基質的溶解。有時,僅僅是樣品溶液的pH值影響,也會使柱子性能極大地破壞。

2、非特異性吸附樣品中強極性或具有強非特異性吸附的物質有可能吸附于填料表面,形成非特異性吸附層,改變柱子的表面活性,使分離性能發生變化,并使柱效降低。例如,有些植物色素經常會吸附于柱頭,使柱子進口端顏色加深,整體柱效下降;有些蛋白質成分會在柱頭變性而沉淀下來。

3、填料流失制造不當的劣質濾板,以及上述的壓力脈沖等。

4、柱外效應過長的連接管線、連接管線內徑太大、過大的檢測池體積、過大的進樣體積等等,均會造成柱效下降。 

二、HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法。

樣品量不足。解決辦法為增加樣品量。

樣品未從柱子中流出。根據樣品的化學性質改變流動相或柱子。

樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器。

檢測器衰減太多。調整衰減即可。

檢測器時間常數太大。解決辦法為降低時間參數。

檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。

檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。

記錄儀測壓范圍不當。調整電壓范圍即可。

流動相流量不合適。調整流速即可。

檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器,重做校正曲線。

三、色譜柱中的流動相會排干嗎? 

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形:不慎未及時補充流動相,泵將溶劑瓶中的流動相吸干了,HPLC系統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了?色譜柱還能使用嗎?事實上,如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干,并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣,泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體,而不能輸送空氣。

相比之下,另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣,整個色譜柱干涸的情況不太容易發生,多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了,因揮發掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了,也不一定就不可救藥了??梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤,恢復到正常狀態。

四、水質對高效液相色譜法(HPLC)的影響?

HPLC最常見的一個問題就是溶劑中的污染物對分析結果的影響。

顆粒: 顆??梢該p壞泵和注射器。顆粒也可以堵塞色譜柱并且熔化它,這會導致回壓增大。顆粒還會表現為另一種固相,可能改變樣品的組分。

有機物:超純水中的有機物可能影響色譜峰的分離度和積分、可能導致鬼峰、還可能改變固定相的選測性以及影響色譜基線。

離子:離子濃度的改變會影響分離結果,部分能吸收UV的離子會對峰產生影響。某些有腐蝕性離子的還會降低高壓輸液泵等配件的使用壽命。

膠體:膠體會不可逆的吸附在固定相上面,影響柱的分離效果。

微生物:微生物會堵塞色譜柱,其代謝產物會增加有機物,顆粒等污染物。

瓶裝純凈水和蒸餾水:目前部分HPLC分析中使用的純凈水,由于瓶裝純凈水和蒸餾水均只是普通純水而不是超純水,水中仍含有少量離子和有機物等雜質,用以配制液相和洗脫液不僅可能污堵昂貴的色譜柱,也影響HPLC定出平坦的基線。

瓶裝純凈水的純化工藝:通常包括吸附、過濾、反滲透等,對顆粒性有機物的去除效果較好,但對微量離子及有機物的去除卻不能滿足高靈敏度的HPLC實驗之需求,并且,由于其包裝通常多為PVC瓶,透氧率高,同時存在一定的化學溶出量,從而污染瓶中的純凈水,尤其是保存一段時間后,水質下降更多,因此表現在HPLC色譜圖上,雖無特定吸收峰,但基線存在較嚴重的不穩干擾。

蒸餾水:是指用蒸餾方法制備的純水??煞忠淮魏投啻握麴s水。水經過一次蒸餾,不揮發的組分殘留在容器中被除去,揮發的組分進入蒸餾水的初始餾分中,通常只收集餾分的中間部分,約占60%,要得到更純的水,可在一次蒸餾水中加入堿性高錳酸鉀溶液,除去有機物和二氧化碳;加入非揮發性的酸(硫酸或磷酸),使氨成為不揮發的銨鹽。通過對雙蒸水進行HPLC檢測時發現,254nm和214nm在22~27分鐘時都出現較強的吸收峰,這表明有疏水性較強的有機物污染,其原因應是蒸餾過程的共沸現象導致了某些揮發性有機物去除不徹底。

超純水機:綜合了反滲透、離子交換、活性炭吸附、膜過濾、超濾及紫外光氧化等多種純化工藝,產水電導率達到18.2MΩ•cm,產水水質超過國標一級水標準且穩定可測,超純水即取即用,不會因儲存引入污染,水質有保證,較之使用瓶裝純凈水或蒸餾水,更能滿足用戶高精度儀器分析的需要。

五、如何判斷何時更換保護柱?

很多實驗人員在使用保護柱的時候出現峰形分叉壓力升高超出儀器報警限才考慮更換保護柱,長期檢測樣品,長時間未更換保護柱而造成分析柱出現污染,故需要即使根據使用情況來更換保護柱。

保護柱的更換頻率通常根據經驗而定,按照每個方法/樣品類型綜合考慮,但是許多分析人員會在完成一定數量的樣品分析或測試一些柱的性能指標(例如增加10%峰展寬或拖尾因子,或降低10%的柱效(塔板數))后更換保護柱。

六、保護柱使用中出現漏液現象?

保護柱上的漏液使用保護柱時通常有兩個地方可能漏液,一個是接頭的地方,另一個位置是保護柱中間的縫隙;接頭的地方漏液,參照上述的流程處理。中間的地方漏液有兩種可能,一種是保護柱芯可能沒有放到底,因為運輸過程中有可能使保護柱柱芯兩端的peek稍有變形,只要仔細一點放進去就好;另一種是由于卡套是手緊式的,表面有手緊時用的紋路,有些客戶認為只要用手擰緊就可以了,但事實上僅僅通過用手來擰緊是不夠的,需要用扳手來稍緊一下,大約手緊后需用扳手繼續擰30~45度角即可。

七、保護柱的維護方法 。

1、一個新的保護柱芯是沒有方向的從第一次使用時開始保護柱芯就賦予了方向,因為固體顆粒物質和強保留物質總是從入口端到達保護柱,并在這一端開始累積。所以柱芯在開始使用后應確認好方向。

2、當發現分析過程出現柱壓太高、柱效下降或分離度下降等影響分離的因素的時候,需要對保護柱進行一下維護。維護的方法如下:

在柱套上做好標記,確認保護柱芯的正反方向;取下保護柱,在不開卡套的前提下將保護柱反接(注意此時不能接色譜柱),用甲醇:水=20/80以3mL/min流速沖洗10min,然后再用純甲醇以3mL/min 流速沖洗10min;

沖洗好后將保護柱正接,打開泵除去保護柱和連接管內的空氣,再連接好色譜柱,象往常一樣使用。

八、何時應更換泵密封圈? 

通常色譜柱壓力異常升高和泵密封圈應定期更換。建議每個液相色譜儀用戶建立一個泵密封圈更換的定期檢修計劃。這應根據泵的使用和流動相組成情況而定。由于它們易磨損的特點,鹽緩沖大大加速密封圈和活塞的磨損。在活塞下面的泵頭上檢測到泄漏時,保留時間不穩定時,或系統壓力不穩定時,都應更換密封圈。請按照以下程序更換所維護的泵的密封圈。

九、柱頭塌陷和相塌陷的區別?

柱頭塌陷:是指色譜柱使用較長的一段時間后,由于填料中硅膠基質或鍵合相的流失,導致柱床松動,在單向壓力的作用下(色譜柱入口端承受絕大部分系統壓力而出口端壓力很?。?,整體表現為色譜柱的入口端出現填料缺失,嚴重時可看到填料的缺口。

相塌陷:是指常規C18柱長時間用高含水量的流動相(>90%)長時間沖洗后,導致保留時間逐漸變短,最后可能在色譜柱上一點保留也沒有的現象。

十、柱頭塌陷和相塌陷分別維護? 

柱頭塌陷:通常在色譜圖上表現出柱效下降、峰形嚴重后拖,有時候也會出現嚴重前拖。造成柱頭塌陷的原因,主要是由流動相和樣品引起的,1.0mL/min的流速,如果pH超標或在色譜柱pH耐受范圍臨界點附近長時間使用,是比較容易造成柱頭塌陷的,此外,硅膠基質的溶解規律是流動pH值控制范圍是2~8,超出范圍就會造成色譜柱出現嚴重的破壞。建議避免使用高濃度緩沖鹽,或者高比例純水相,或者使用耐受強酸性或者強堿性色譜柱,以保證色譜柱具有好的耐受性。

相塌陷:色譜柱出現了相塌陷后,通常用純乙腈或甲醇持續沖洗可以使出現相塌陷的色譜柱恢復到原來的狀態,完全恢復需要比較長的時間,通常30分鐘到1個小時。



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